Wu Enhui, Qiao Liang*
Kimya Bölümü, Fudan Üniversitesi, Şanghay 200433, Çin
Mikroorganizmalar insan hastalıkları ve sağlığıyla yakından ilgilidir. Mikrobiyal toplulukların bileşiminin ve işlevlerinin nasıl anlaşılacağı, acilen araştırılması gereken önemli bir konudur. Son yıllarda metaproteomik, mikroorganizmaların bileşimini ve işlevini incelemek için önemli bir teknik araç haline geldi. Bununla birlikte, mikrobiyal topluluk örneklerinin karmaşıklığı ve yüksek heterojenliği nedeniyle, örnek işleme, kütle spektrometresi veri toplama ve veri analizi, şu anda metaproteomiklerin karşılaştığı üç büyük zorluk haline geldi. Metaproteomik analizde, farklı türdeki örneklerin ön arıtımını optimize etmek ve farklı mikrobiyal ayırma, zenginleştirme, ekstraksiyon ve lizis şemalarını benimsemek genellikle gereklidir. Tek bir türün proteomuna benzer şekilde, metaproteomikteki kütle spektrometresi veri toplama modları, veriye bağlı edinim (DDA) modunu ve veriden bağımsız edinim (DIA) modunu içerir. DIA veri toplama modu, numunenin peptid bilgilerini tamamen toplayabilir ve büyük bir geliştirme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, metaproteom örneklerinin karmaşıklığı nedeniyle, DIA veri analizi, metaproteomiklerin derinlemesine kapsamını engelleyen büyük bir sorun haline gelmiştir. Veri analizi açısından en önemli adım, bir protein dizisi veri tabanının oluşturulmasıdır. Veritabanının boyutu ve eksiksizliği, yalnızca tanımlamaların sayısı üzerinde büyük bir etkiye sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda tür ve fonksiyonel düzeylerdeki analizleri de etkiler. Şu anda, bir metaproteom veri tabanının oluşturulması için altın standart, metagenom bazlı bir protein dizisi veri tabanıdır. Aynı zamanda, yinelemeli aramaya dayalı genel veritabanı filtreleme yönteminin de güçlü bir pratik değere sahip olduğu kanıtlanmıştır. Spesifik veri analizi stratejileri açısından bakıldığında, peptid merkezli DIA veri analizi yöntemleri mutlak bir ana akım haline gelmiştir. Derin öğrenme ve yapay zekanın gelişmesiyle birlikte makroproteomik veri analizinin doğruluğunu, kapsamını ve analiz hızını büyük ölçüde artıracaktır. Aşağı yönlü biyoinformatik analiz açısından, son yıllarda mikrobiyal toplulukların kompozisyonunu elde etmek için protein seviyesinde, peptid seviyesinde ve gen seviyesinde tür açıklaması yapabilen bir dizi açıklama aracı geliştirilmiştir. Diğer omik yöntemlerle karşılaştırıldığında mikrobiyal toplulukların fonksiyonel analizi, makroproteomiklerin benzersiz bir özelliğidir. Makroproteomik, mikrobiyal toplulukların çoklu omik analizinin önemli bir parçası haline gelmiştir ve kapsama derinliği, tespit hassasiyeti ve veri analizinin bütünlüğü açısından hala büyük bir gelişme potansiyeline sahiptir.
01Numune ön işlemi
Şu anda metaproteomik teknolojisi insan mikrobiyomu, toprak, gıda, okyanus, aktif çamur ve diğer alanların araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Tek bir türün proteom analiziyle karşılaştırıldığında, karmaşık numunelerin metaproteomunun numune ön işlemi daha fazla zorlukla karşı karşıyadır. Gerçek örneklerdeki mikrobiyal bileşim karmaşıktır, dinamik bolluk aralığı geniştir, farklı mikroorganizma türlerinin hücre duvarı yapısı çok farklıdır ve örnekler sıklıkla büyük miktarda konakçı protein ve diğer safsızlıkları içerir. Bu nedenle, metaproteom analizinde genellikle farklı türdeki örnekleri optimize etmek ve farklı mikrobiyal ayırma, zenginleştirme, ekstraksiyon ve lizis şemalarını benimsemek gerekir.
Farklı örneklerden mikrobiyal metaproteomların ekstraksiyonu, bazı benzerliklerin yanı sıra bazı farklılıklara da sahiptir, ancak şu anda farklı metaproteom örnekleri türleri için birleşik bir ön işleme sürecinin eksikliği vardır.
02Kütle spektrometresi veri toplama
Av tüfeği proteom analizinde, ön işlemden sonra peptit karışımı ilk önce kromatografik kolonda ayrılır ve ardından iyonizasyondan sonra veri toplama için kütle spektrometresine girer. Tek tür proteom analizine benzer şekilde, makroproteom analizindeki kütle spektrometresi veri toplama modları, DDA modunu ve DIA modunu içerir.
Kütle spektrometresi cihazlarının sürekli yinelenmesi ve güncellenmesiyle, metaproteoma daha yüksek hassasiyet ve çözünürlüğe sahip kütle spektrometresi cihazları uygulanır ve metaproteom analizinin kapsama derinliği de sürekli olarak geliştirilir. Uzun bir süredir, Orbitrap liderliğindeki bir dizi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometri cihazı, metaproteomda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Orijinal metnin Tablo 1'i, örnek türü, analiz stratejisi, kütle spektrometri cihazı, edinim yöntemi, analiz yazılımı ve tanımlama sayısı açısından 2011'den günümüze metaproteomik üzerine bazı temsili çalışmaları göstermektedir.
03Kütle spektrometresi veri analizi
3.1 DDA veri analizi stratejisi
3.1.1 Veritabanı Araması
3.1.2yenisıralama stratejisi
3.2 DIA veri analizi stratejisi
04Tür sınıflandırması ve işlevsel açıklamalar
Farklı taksonomik seviyelerdeki mikrobiyal toplulukların bileşimi, mikrobiyom araştırmalarındaki temel araştırma alanlarından biridir. Son yıllarda, mikrobiyal toplulukların kompozisyonunu elde etmek amacıyla türlere protein düzeyinde, peptid düzeyinde ve gen düzeyinde açıklama eklemek için bir dizi açıklama aracı geliştirilmiştir.
Fonksiyonel açıklamanın özü, hedef protein sekansını fonksiyonel protein sekansı veritabanıyla karşılaştırmaktır. GO, COG, KEGG, EggNOG vb. gibi gen fonksiyonu veritabanları kullanılarak makroproteomlar tarafından tanımlanan proteinler üzerinde farklı fonksiyonel açıklama analizleri gerçekleştirilebilir. Ek açıklama araçları Blast2GO, DAVID, KOBAS vb.'yi içerir.
05Özet ve Görünüm
Mikroorganizmalar insan sağlığı ve hastalıklarında önemli rol oynamaktadır. Son yıllarda metaproteomik, mikrobiyal toplulukların işlevini incelemek için önemli bir teknik araç haline geldi. Metaproteomiklerin analitik süreci, tek tür proteomiklerinkine benzer, ancak metaproteomiklerin araştırma nesnesinin karmaşıklığından dolayı, numune ön işleminden, veri toplamadan veri analizine kadar her analiz adımında özel araştırma stratejilerinin benimsenmesi gerekir. Şu anda, ön arıtma yöntemlerinin gelişmesi, kütle spektrometri teknolojisinin sürekli yenilenmesi ve biyoinformatiğin hızlı gelişimi sayesinde metaproteomik, tanımlama derinliği ve uygulama kapsamı açısından büyük ilerleme kaydetmiştir.
Makroproteom örneklerinin ön işleme tabi tutulması sürecinde öncelikle örneğin doğası dikkate alınmalıdır. Mikroproteomların çevresel hücrelerden ve proteinlerden nasıl ayrılacağı, makroproteomların karşılaştığı en önemli zorluklardan biridir ve ayırma verimliliği ile mikrobiyal kayıp arasındaki denge, çözülmesi gereken acil bir sorundur. İkinci olarak, mikroorganizmaların protein ekstraksiyonunda, farklı bakterilerin yapısal heterojenliğinden kaynaklanan farklılıklar dikkate alınmalıdır. İz aralığındaki makroproteom numuneleri ayrıca spesifik ön arıtma yöntemleri gerektirir.
Kütle spektrometresi cihazları açısından, ana akım kütle spektrometresi cihazları, LTQ-Orbitrap ve Q Exactive gibi Orbitrap kütle analizörlerini temel alan kütle spektrometrelerinden, timsTOF Pro gibi iyon hareketliliğine bağlı uçuş süresi kütle analizörlerine dayalı kütle spektrometrelerine geçiş sürecinden geçmiştir. . İyon hareketliliği boyut bilgisine sahip timsTOF serisi cihazlar, yüksek tespit doğruluğuna, düşük tespit limitine ve iyi tekrarlanabilirliğe sahiptir. Tek bir türün proteomu, metaproteomu ve metabolomu gibi kütle spektrometresi tespiti gerektiren çeşitli araştırma alanlarında giderek önemli araçlar haline geldiler. Kütle spektrometresi cihazlarının dinamik aralığının uzun süredir metaproteom araştırmalarının protein kapsama derinliğini sınırladığını belirtmekte fayda var. Gelecekte, daha geniş dinamik aralığa sahip kütle spektrometri cihazları, metaproteomlarda protein tanımlamanın hassasiyetini ve doğruluğunu artırabilir.
Kütle spektrometresi veri toplama için, DIA veri toplama modu tek bir türün proteomunda yaygın olarak benimsenmiş olmasına rağmen, mevcut makroproteom analizlerinin çoğu hala DDA veri toplama modunu kullanmaktadır. DIA veri toplama modu, numunenin fragman iyon bilgisini tam olarak elde edebilir ve DDA veri toplama moduyla karşılaştırıldığında, makroproteom örneğinin peptit bilgisini tam olarak elde etme potansiyeline sahiptir. Ancak DIA verilerinin yüksek karmaşıklığı nedeniyle DIA makroproteom verilerinin analizi hala büyük zorluklarla karşı karşıyadır. Yapay zeka ve derin öğrenmenin geliştirilmesinin, DIA veri analizinin doğruluğunu ve eksiksizliğini artırması bekleniyor.
Metaproteomiklerin veri analizinde temel adımlardan biri protein dizisi veri tabanının oluşturulmasıdır. Bağırsak florası gibi popüler araştırma alanları için IGC ve HMP gibi bağırsak mikrobiyal veritabanları kullanılabilir ve iyi tanımlama sonuçları elde edilmiştir. Diğer çoğu metaproteomik analiz için en etkili veri tabanı oluşturma stratejisi, metagenomik sıralama verilerine dayalı olarak numuneye özgü bir protein dizisi veri tabanı oluşturmaktır. Yüksek karmaşıklığa ve geniş dinamik aralığa sahip mikrobiyal topluluk numuneleri için, düşük bolluğa sahip türlerin tanımlanmasını artırmak için sıralama derinliğini artırmak, böylece protein dizisi veri tabanının kapsamını geliştirmek gerekir. Sıralama verileri eksik olduğunda, genel veritabanını optimize etmek için yinelemeli bir arama yöntemi kullanılabilir. Ancak yinelemeli arama FDR kalite kontrolünü etkileyebilir, bu nedenle arama sonuçlarının dikkatle kontrol edilmesi gerekir. Ek olarak, geleneksel FDR kalite kontrol modellerinin metaproteomik analizde uygulanabilirliği hala araştırılmaya değerdir. Arama stratejisi açısından hibrit spektral kütüphane stratejisi, DIA metaproteomiklerinin kapsama derinliğini artırabilir. Son yıllarda, derin öğrenmeye dayalı olarak oluşturulan tahmin edilen spektral kütüphane, DIA proteomik alanında üstün performans göstermiştir. Bununla birlikte, metaproteom veritabanları genellikle milyonlarca protein girişi içerir; bu da büyük ölçekte tahmin edilen spektral kütüphanelerle sonuçlanır, çok fazla bilgi işlem kaynağı tüketir ve geniş bir arama alanıyla sonuçlanır. Ek olarak, metaproteomlardaki protein dizileri arasındaki benzerlik büyük ölçüde değişiklik gösterir, bu da spektral kütüphane tahmin modelinin doğruluğunu sağlamayı zorlaştırır, dolayısıyla tahmin edilen spektral kütüphaneler metaproteomikte yaygın olarak kullanılmamıştır. Ek olarak, diziye oldukça benzer proteinlerin metaproteomik analizine uygulanacak yeni protein çıkarımı ve sınıflandırma açıklama stratejilerinin geliştirilmesi gerekmektedir.
Özetle, yeni ortaya çıkan bir mikrobiyom araştırma teknolojisi olarak metaproteomik teknolojisi, önemli araştırma sonuçları elde etmiş ve aynı zamanda büyük bir gelişme potansiyeline sahiptir.
Gönderim zamanı: Ağu-30-2024