Sıvı kromatografisi, ham maddeler, ara ürünler, preparatlar ve ambalaj malzemelerindeki her bir bileşenin içeriğini ve safsızlıkları test etmek için ana yöntemdir, ancak birçok maddenin güvenebileceği standart yöntemler yoktur, bu nedenle yeni yöntemlerin geliştirilmesi kaçınılmazdır. Sıvı faz yöntemlerinin geliştirilmesinde kromatografik kolon, sıvı kromatografinin çekirdeğini oluşturur, dolayısıyla uygun bir kromatografik kolonun nasıl seçileceği çok önemlidir. Bu makalede yazar, bir sıvı kromatografi kolonunun üç açıdan nasıl seçileceğini açıklayacaktır: genel fikirler, dikkat edilmesi gereken noktalar ve uygulama kapsamı.
A. Sıvı kromatografi kolonlarının seçimine ilişkin genel fikirler
1. Analitin fiziksel ve kimyasal özelliklerini değerlendirin: kimyasal yapı, çözünürlük, stabilite (oksidizasyonun/indirgenmesinin/hidrolize edilmesinin kolay olup olmadığı gibi), asitlik ve bazlık vb. gibi, özellikle kimyasal yapı anahtardır konjuge grubun güçlü ultraviyole absorpsiyonu ve güçlü floresansa sahip olması gibi özelliklerin belirlenmesinde faktör;
2. Analizin amacını belirleyin: yüksek ayırma, yüksek kolon verimliliği, kısa analiz süresi, yüksek hassasiyet, yüksek basınç direnci, uzun kolon ömrü, düşük maliyet vb. gerekli olup olmadığı;
- Uygun bir kromatografik sütun seçin: kromatografik dolgu maddesinin bileşimini, parçacık boyutu, gözenek boyutu, sıcaklık toleransı, pH toleransı, analitin adsorpsiyonu vb. gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerini anlayın.
- Sıvı kromatografi kolonlarının seçiminde dikkat edilecek hususlar
Bu bölümde, kromatografi kolonunun fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından bir kromatografi kolonu seçerken dikkate alınması gereken faktörler tartışılacaktır. 2.1 Dolgu matrisi
2.1.1 Silika jel matrisi Çoğu sıvı kromatografi kolonunun dolgu matrisi silika jeldir. Bu tür dolgu maddeleri yüksek saflığa, düşük maliyete, yüksek mekanik dayanıklılığa sahiptir ve grupları değiştirmek kolaydır (fenil bağı, amino bağı, siyano bağı vb.), ancak tolere ettiği pH değeri ve sıcaklık aralığı sınırlıdır: Çoğu silika jel matris dolgu maddesinin pH aralığı 2 ila 8'dir, ancak özel olarak değiştirilmiş silika jel bağlı fazların pH aralığı 1,5 ila 10 kadar geniş olabilir ve ayrıca düşük pH'ta stabil olan özel olarak değiştirilmiş silika jel bağlı fazlar da vardır. pH 1 ila 8 arasında stabil olan Agilent ZORBAX RRHD stabilbond-C18 gibi; silika jel matrisinin üst sıcaklık sınırı genellikle 60 °C'dir ve bazı kromatografi kolonları, yüksek pH'ta 40 °C'lik bir sıcaklığı tolere edebilir.
2.1.2 Polimer matrisi Polimer dolgu maddeleri çoğunlukla polistiren-divinilbenzen veya polimetakrilattır. Avantajları, geniş bir pH aralığını tolere edebilmeleri, 1 ila 14 aralığında kullanılabilmesi ve yüksek sıcaklıklara (80 °C'nin üzerine çıkabilen) daha dayanıklı olmalarıdır. Silika bazlı C18 dolgu maddeleri ile karşılaştırıldığında, bu tür dolgu maddeleri daha güçlü hidrofobikliğe sahiptir ve makro gözenekli polimer, proteinler gibi numunelerin ayrılmasında çok etkilidir. Dezavantajları ise kolon veriminin daha düşük olması ve mekanik mukavemetinin silika esaslı dolgulara göre daha zayıf olmasıdır. 2.2 Parçacık şekli
Çoğu modern HPLC dolgu maddesi küresel parçacıklardır, ancak bazen düzensiz parçacıklardır. Küresel parçacıklar daha düşük kolon basıncı, daha yüksek kolon verimliliği, stabilite ve daha uzun ömür sağlayabilir; yüksek viskoziteli hareketli fazlar (fosforik asit gibi) kullanıldığında veya numune çözeltisi viskoz olduğunda, düzensiz parçacıklar daha büyük bir spesifik yüzey alanına sahiptir, bu da iki fazın tam etkisine daha elverişlidir ve fiyatı nispeten düşüktür. 2.3 Parçacık boyutu
Parçacık boyutu ne kadar küçük olursa, kolon verimliliği o kadar yüksek olur ve ayırma o kadar yüksek olur, ancak yüksek basınç direnci o kadar kötü olur. En yaygın kullanılan kolon 5 μm parçacık boyutlu kolondur; Ayırma gereksinimi yüksekse, bazı karmaşık matris ve çok bileşenli numunelerin ayırma problemini çözmeye yardımcı olan 1,5-3 μm'lik bir dolgu maddesi seçilebilir. UPLC, 1,5 μm dolgu maddeleri kullanabilir; Yarı hazırlayıcı veya hazırlayıcı kolonlar için sıklıkla 10 μm veya daha büyük parçacık boyutuna sahip dolgu maddeleri kullanılır. 2.4 Karbon içeriği
Karbon içeriği, spesifik yüzey alanı ve bağlı faz kapsamı ile ilişkili olan silika jel yüzeyindeki bağlı fazın oranını ifade eder. Yüksek karbon içeriği, yüksek sütun kapasitesi ve yüksek çözünürlük sağlar ve genellikle yüksek ayırma gerektiren karmaşık numuneler için kullanılır, ancak iki faz arasındaki uzun etkileşim süresi nedeniyle analiz süresi uzundur; düşük karbon içerikli kromatografik kolonlar daha kısa analiz süresine sahiptir ve farklı seçicilikler gösterebilir ve sıklıkla hızlı analiz gerektiren basit numuneler ve yüksek sulu faz koşulları gerektiren numuneler için kullanılır. Genel olarak C18'in karbon içeriği %7 ile %19 arasında değişir. 2.5 Gözenek boyutu ve spesifik yüzey alanı
HPLC adsorpsiyon ortamı gözenekli parçacıklardır ve etkileşimlerin çoğu gözeneklerde gerçekleşir. Bu nedenle moleküllerin adsorbe edilmesi ve ayrılması için gözeneklere girmesi gerekir.
Gözenek boyutu ve spesifik yüzey alanı birbirini tamamlayan iki kavramdır. Küçük gözenek boyutu, büyük spesifik yüzey alanı anlamına gelir ve bunun tersi de geçerlidir. Büyük bir spesifik yüzey alanı, numune molekülleri ile bağlı fazlar arasındaki etkileşimi artırabilir, tutmayı artırabilir, numune yüklemeyi ve kolon kapasitesini artırabilir ve karmaşık bileşenlerin ayrılmasını sağlayabilir. Tamamen gözenekli dolgular bu tip dolgulara aittir. Yüksek ayırma gereksinimlerine sahip olanlar için, geniş spesifik yüzey alanına sahip dolgu maddelerinin seçilmesi tavsiye edilir; Küçük spesifik yüzey alanı, karşı basıncı azaltabilir, kolon verimliliğini artırabilir ve gradyan analizi için uygun olan denge süresini azaltabilir. Çekirdek-kabuk dolgular bu tip dolgulara aittir. Ayırmanın sağlanması amacıyla, yüksek analiz verimliliği gereksinimleri olanlar için spesifik yüzey alanı küçük olan dolguların seçilmesi önerilir. 2.6 Gözenek hacmi ve mekanik dayanım
"Gözenek hacmi" olarak da bilinen gözenek hacmi, birim parçacık başına boş hacmin boyutunu ifade eder. Dolgu maddesinin mekanik mukavemetini iyi yansıtabilir. Büyük gözenek hacmine sahip dolgu maddelerinin mekanik mukavemeti, küçük gözenek hacmine sahip dolgu maddelerine göre biraz daha zayıftır. Gözenek hacmi 1,5 mL/g'den az veya buna eşit olan dolgu maddeleri çoğunlukla HPLC ayırma için kullanılırken, gözenek hacmi 1,5 mL/g'den büyük olan dolgu maddeleri esas olarak moleküler dışlama kromatografisi ve düşük basınçlı kromatografi için kullanılır. 2.7 Sınırlandırma oranı
Kapatma, bileşikler ile açıkta kalan silanol grupları (alkali bileşikler ve silanol grupları arasındaki iyonik bağlanma, van der Waals kuvvetleri ve asidik bileşikler ile silanol grupları arasındaki hidrojen bağları gibi) arasındaki etkileşimin neden olduğu kuyruk tepe noktalarını azaltabilir, böylece kolon verimliliğini ve tepe şeklini iyileştirebilir . Kapaksız bağlı fazlar, özellikle polar numuneler için başlıklı bağlı fazlara göre farklı seçicilikler üretecektir.
- Farklı sıvı kromatografi kolonlarının uygulama kapsamı
Bu bölümde farklı tipteki sıvı kromatografi kolonlarının uygulama kapsamı bazı durumlar üzerinden açıklanacaktır.
3.1 Ters fazlı C18 kromatografik kolon
C18 kolonu, çoğu organik maddenin içerik ve safsızlık testlerini karşılayabilen ve orta polar, zayıf polar ve polar olmayan maddelere uygulanabilen, en yaygın kullanılan ters fazlı kolondur. C18 kromatografik kolonun tipi ve spesifikasyonu, spesifik ayırma gerekliliklerine göre seçilmelidir. Örneğin, yüksek ayırma gereksinimleri olan maddeler için sıklıkla 5 μm*4,6 mm*250 mm spesifikasyonları kullanılır; karmaşık ayırma matrislerine ve benzer polariteye sahip maddeler için 4 μm*4,6 mm*250 mm spesifikasyonları veya daha küçük parçacık boyutları kullanılabilir. Örneğin yazar, selekoksib API'sindeki iki genotoksik safsızlığı tespit etmek için 3 μm*4,6 mm*250 mm'lik bir sütun kullanmıştır. İki maddenin ayrılması mükemmel olan 2,9'a ulaşabilir. Ayrıca ayırmayı sağlamak amacıyla hızlı analiz gerekiyorsa genellikle 10 mm veya 15 mm'lik kısa bir sütun seçilir. Örneğin yazar, piperakin fosfat API'sindeki genotoksik bir safsızlığı tespit etmek için LC-MS/MS kullandığında, 3 μm*2,1 mm*100 mm'lik bir sütun kullanıldı. Safsızlık ile ana bileşen arasındaki ayrım 2,0 idi ve bir numunenin tespiti 5 dakikada tamamlanabiliyor. 3.2 Ters fazlı fenil kolonu
Fenil sütunu aynı zamanda bir tür ters fazlı sütundur. Bu tip kolon aromatik bileşikler için güçlü seçiciliğe sahiptir. Sıradan C18 kolonu ile ölçülen aromatik bileşiklerin tepkisi zayıfsa fenil kolonunu değiştirmeyi düşünebilirsiniz. Örneğin, selekoksib API'yi yaparken, aynı üreticinin fenil kolonu ve aynı spesifikasyon (tümü 5 μm*4,6 mm*250 mm) tarafından ölçülen ana bileşen tepkisi, C18 kolonununkinin yaklaşık 7 katıydı. 3.3 Normal faz sütunu
Ters fazlı kolona etkili bir tamamlayıcı olarak normal fazlı kolon, yüksek polariteli bileşikler için uygundur. Ters faz kolonunda %90'dan fazla sulu faz ile elüsyon yapılırken zirve hala çok hızlıysa ve hatta solvent zirvesine yakınsa ve onunla örtüşüyorsa, normal faz kolonunu değiştirmeyi düşünebilirsiniz. Bu sütun türü hilik sütunu, amino sütunu, siyano sütununu vb. içerir.
3.3.1 Hilic sütunu Hilic sütunu genellikle polar maddelere tepkiyi arttırmak için bağlı alkil zincirine hidrofilik gruplar yerleştirir. Bu tip kolon şekerli maddelerin analizi için uygundur. Yazar, ksiloz ve türevlerinin içeriğini ve ilgili maddelerini yaparken bu tür sütunları kullanmıştır. Bir ksiloz türevinin izomerleri de iyi bir şekilde ayrılabilir;
3.3.2 Amino sütunu ve siyano sütunu Amino sütunu ve siyano sütunu, özel maddelere yönelik seçiciliği geliştirmek için sırasıyla bağlı alkil zincirinin sonunda amino ve siyano modifikasyonlarının eklenmesini ifade eder: örneğin, amino sütunu iyi bir seçimdir şekerlerin, amino asitlerin, bazların ve amidlerin ayrılması için; siyano kolonu, konjuge bağların varlığı nedeniyle hidrojenlenmiş ve hidrojenlenmemiş yapısal benzer maddeleri ayırırken daha iyi seçiciliğe sahiptir. Amino sütunu ve siyano sütunu genellikle normal fazlı sütun ve ters fazlı sütun arasında değiştirilebilir, ancak sık sık geçiş yapılması önerilmez. 3.4 Kiral sütun
Kiral kolon, adından da anlaşılacağı gibi, özellikle farmasötik alanında kiral bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Bu tip kolon, geleneksel ters fazlı ve normal fazlı kolonların izomerlerin ayrılmasını sağlayamadığı durumlarda düşünülebilir. Örneğin yazar, 1,2-difeniletilendiaminin iki izomerini ayırmak için 5 μm*4,6 mm*250 mm'lik bir kiral sütun kullanmıştır: (1S, 2S)-1,2-difeniletilendiamin ve (1R, 2R)-1,2 -difeniletilendiamin ve ikisi arasındaki ayrım yaklaşık 2,0'a ulaştı. Bununla birlikte kiral kolonlar diğer kolon türlerine göre genellikle 1W+/adet olmak üzere daha pahalıdır. Bu tür kolonlara ihtiyaç varsa birimin yeterli bütçe yapması gerekiyor. 3.5 İyon değişim kolonu
İyon değiştirme kolonları iyonlar, proteinler, nükleik asitler ve bazı şekerli maddeler gibi yüklü iyonların ayrılması ve analizi için uygundur. Dolgu türüne göre katyon değiştirme kolonları, anyon değiştirme kolonları ve kuvvetli katyon değiştirme kolonları olarak ayrılırlar.
Katyon değiştirme kolonları, esas olarak amino asitler gibi katyonik maddelerin analizi için uygun olan kalsiyum bazlı ve hidrojen bazlı kolonları içerir. Örneğin yazar, bir yıkama solüsyonunda kalsiyum glukonat ve kalsiyum asetatı analiz ederken kalsiyum bazlı kolonlar kullanmıştır. Her iki maddenin de λ=210nm'de güçlü tepkileri vardı ve ayrılma derecesi 3,0'a ulaştı; yazar glikozla ilgili maddeleri analiz ederken hidrojen bazlı sütunlar kullandı. Birkaç önemli ilgili madde (maltoz, maltotrioz ve fruktoz), 0,5 ppm kadar düşük bir tespit limiti ve 2,0-2,5'lik bir ayırma derecesi ile diferansiyel dedektörler altında yüksek hassasiyete sahipti.
Anyon değiştirme kolonları esas olarak organik asitler ve halojen iyonları gibi anyonik maddelerin analizi için uygundur; Güçlü katyon değiştirme kolonları daha yüksek iyon değiştirme kapasitesine ve seçiciliğe sahiptir ve karmaşık numunelerin ayrılması ve analizi için uygundur.
Yukarıdakiler, yazarın kendi deneyimiyle birleştirilmiş birkaç yaygın sıvı kromatografi kolonunun türleri ve uygulama aralıklarına yalnızca bir giriş niteliğindedir. Gerçek uygulamalarda büyük gözenekli kromatografi kolonları, küçük gözenekli kromatografi kolonları, afinite kromatografi kolonları, çok modlu kromatografi kolonları, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi kolonları (UHPLC), süperkritik akışkan kromatografi kolonları gibi başka özel tipte kromatografik kolonlar da mevcuttur. SFC), vb. Farklı alanlarda önemli bir rol oynarlar. Spesifik kromatografik kolon tipi, numunenin yapısına ve özelliklerine, ayırma gerekliliklerine ve diğer amaçlara göre seçilmelidir.
Gönderim zamanı: Haziran-14-2024