Sıvı Kromatografisi ile Kantitatif Analizin Prensipleri ve Yöntemleri

Sıvı kromatografinin ayırma mekanizması, karışımdaki bileşenlerin iki faza olan afinitesindeki farklılığa dayanmaktadır.

Farklı sabit fazlara göre sıvı kromatografisi, sıvı-katı kromatografisi, sıvı-sıvı kromatografisi ve bağlı faz kromatografisi olarak ayrılır.En yaygın olarak kullanılanlar, dolgu maddesi olarak silika jeli ile sıvı-katı kromatografisi ve matris olarak mikrosilika ile bağlı faz kromatografisidir.

Sabit fazın formuna göre sıvı kromatografisi kolon kromatografisi, kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisine ayrılabilir.Adsorpsiyon kapasitesine göre adsorpsiyon kromatografisi, bölme kromatografisi, iyon değişim kromatografisi ve jel geçirgenlik kromatografisine ayrılabilir.

Son yıllarda, ayırma etkisini geliştirmek için mobil fazın yüksek basınç altında hızlı bir şekilde akmasını sağlamak için sıvı kolon kromatografi sistemine yüksek basınçlı bir sıvı akış sistemi eklendi, bu nedenle yüksek verimli (yüksek basınçlı olarak da bilinir) sıvı kromatografisi ortaya çıktı.

PARÇA
01 Sıvı Kromatografinin Kantitatif Analizi Prensibi

Kalitatif esasına göre nicelik belirlemek için standart olarak saf maddeler gereklidir;

Sıvı kromatografi ölçümü nispeten kantitatif bir yöntemdir: yani karışımdaki analitin miktarı, bilinen miktardaki saf standart numuneden tahmin edilir.

PARÇA
02 Sıvı Kromatografi ile Kantifikasyonun Esasları

Ölçülen bileşenin (W) miktarı, yanıt değeri (A) (tepe yüksekliği veya tepe alanı), W=f×A ile orantılıdır.

Kantitatif düzeltme faktörü (f): Kantitatif hesaplama formülünün orantı sabitidir ve fiziksel anlamı, birim tepki değeri (tepe alanı) ile temsil edilen ölçülen bileşenin miktarıdır.

Kantitatif düzeltme faktörü, bilinen standart numune miktarından ve yanıt değerinden elde edilebilir.

Bilinmeyen bileşenin tepki değerini ölçün ve bileşenin miktarı niceliksel düzeltme faktörüyle elde edilebilir.

PARÇA
03 Kantitatif analizde ortak terimler

Numune (numune): kromatografik analiz için bir analit içeren bir çözelti.Standart ve bilinmeyen örneklere ayrılmıştır.

Standart: Bilinen konsantrasyona sahip saf ürün.Bilinmeyen numune (bilinmiyor): Konsantrasyonu test edilecek karışım.

Numune ağırlığı: Test edilecek numunenin orijinal ağırlığıdır.

Seyreltme: Bilinmeyen numunenin seyreltme faktörü.

Bileşen: Kantitatif olarak analiz edilecek kromatografik pik, yani içeriği bilinmeyen analit.

Bileşen miktarı (miktar): test edilecek maddenin içeriği (veya konsantrasyonu).

Bütünlük: Bir kromatografik pikin tepe alanının bir bilgisayar tarafından ölçülmesine yönelik hesaplamalı işlem.

Kalibrasyon eğrisi: Analitin bilinmeyen içeriğini belirlemek için kullanılan, standart maddenin bilinen bir miktarından oluşturulan, bileşen içeriğine karşı yanıt değerinin doğrusal bir eğrisi.

PARÇA
04 Sıvı Kromatografinin Kantitatif Analizi

1. Kantitatif analize uygun bir kromatografik yöntem seçin:

l Algılanan bileşenin zirvesini onaylayın ve 1,5'ten büyük bir çözünürlük (R) elde edin

l Test edilen bileşenlerin kromatografik piklerinin tutarlılığını (saflığını) belirleyin

l Yöntemin tespit limitini ve miktar limitini belirleyin;hassasiyet ve doğrusal aralık

2. Farklı konsantrasyonlardaki standart numunelerle bir kalibrasyon eğrisi oluşturun

3. Kantitatif yöntemlerin doğruluğunu ve kesinliğini kontrol edin

4. Numune toplama, veri işleme ve sonuçları raporlamak için ilgili kromatografi yönetim yazılımını kullanın

PARÇA
05 Kantitatif zirvelerin belirlenmesi (niteliksel)

Ölçülecek her kromatografik piki niteliksel olarak tanımlayın

İlk olarak, ölçülecek kromatografik pikin alıkonma süresini (Rt) belirlemek için standart numuneyi kullanın.Tutma süresini karşılaştırarak bilinmeyen numunedeki her kromatografik pike karşılık gelen bileşeni bulun.Kromatografik kalitatif yöntem, alıkonma süresini standart numuneyle karşılaştırmaktır.Kriter Yetersizdaha fazla onay (niteliksel)

1. Standart ekleme yöntemi

2. Diğer yöntemleri aynı anda kullanın: diğer kromatografik yöntemler (mekanizmayı değiştirin, örneğin: farklı kromatografik sütunların kullanılması), diğer dedektörler (PDA: spektrum karşılaştırması, spektrum kütüphanesi araştırması; MS: kütle spektrumu analizi, spektrum kütüphanesi araştırması)

3. Diğer araçlar ve yöntemler

PARÇA
06 Kantitatif Zirve Tutarlılığının Doğrulanması

Kromatografik tepe tutarlılığını (saflık) doğrulayın

Her kromatografik pikin altında yalnızca tek bir ölçülen bileşen olduğundan emin olun

Birlikte elüsyon yapan maddelerden (safsızlıklar) kaynaklanan etkileşimi kontrol edin

Kromatografik Tepe Tutarlılığının (Saflık) Doğrulanması Yöntemleri

Spektrogramları Fotodiyot Matris (PDA) Dedektörleriyle Karşılaştırma

En Yüksek Saflık Tanımlaması

2996 Saflık Açısı Teorisi

BÖLÜM 07'de yaygın olarak kullanılan niceliksel yöntemler

Standart eğri yöntemi, harici standart yöntem ve dahili standart yönteme bölünmüştür:

1. Harici standart yöntem: Sıvı kromatografide en çok kullanılan

Bilinen konsantrasyonlara sahip bir dizi standart numune, standart numuneler olarak test edilecek bileşiklerin saf numuneleri kullanılarak hazırlandı.yanıt değerine (tepe alanı) kadar sütuna enjekte edilir.
Belirli bir aralıkta, standart numunenin konsantrasyonu ile yanıt değeri arasında yani W= f×A arasında iyi bir doğrusal ilişki vardır ve standart bir eğri oluşturulur.

Tamamen aynı deneysel koşullar altında, ölçülecek bileşenin tepki değerini elde etmek için bilinmeyen numuneyi enjekte edin.Bilinen f katsayısına göre ölçülecek bileşenin konsantrasyonu elde edilebilir.

Harici standart yöntemin avantajları:basit işlem ve hesaplama, yaygın olarak kullanılan niceliksel bir yöntemdir;her bir bileşenin tespit edilmesine ve ayrıştırılmasına gerek yoktur;standart numune gereklidir;standart numunenin ve bilinmeyen numunenin ölçüm koşulları tutarlı olmalıdır;Enjeksiyon hacmi kesin olmalıdır.

Harici standart yöntemin dezavantajları:Dedektörün duyarlılığı, akış hızı ve mobil fazın bileşiminin değiştirilemeyeceği gibi deneysel koşulların yüksek olması gerekir;Her enjeksiyonun hacmi iyi bir tekrarlanabilirliğe sahip olmalıdır.

2. Dahili standart yöntemi: doğru fakat zahmetli, en çok standart yöntemlerde kullanılır

Karma standart oluşturmak için standarda bilinen miktarda iç standart eklenir ve konsantrasyonu bilinen bir dizi çalışma standardı hazırlanır.Karışık standartta standardın iç standarda molar oranı değişmeden kalır.Kromatografik kolona enjekte edin ve yanıt değeri olarak (standart numune tepe alanı/dahili standart numune zirve alanı) alın.Yanıt değeri ile çalışma standardının konsantrasyonu arasındaki doğrusal ilişkiye göre, yani W= f×A, standart bir eğri yapılır.

Bilinmeyen numuneye bilinen miktarda iç standart eklenir ve ölçülecek bileşenin tepki değerini elde etmek için kolona enjekte edilir.Bilinen f katsayısına göre ölçülecek bileşenin konsantrasyonu elde edilebilir.

Dahili standart yöntemin özellikleri:İşlem sırasında numune ve iç standart birlikte karıştırılır ve kromatografik kolona enjekte edilir, böylece ölçülen bileşen miktarının karışık çözeltideki iç standarda oranı sabit olduğu sürece numune hacmindeki değişiklik olur. niceliksel sonuçları etkilemeyecektir..Dahili standart yöntem, örnek hacminin ve hatta mobil fazın ve dedektörün etkisini dengeler, dolayısıyla harici standart yöntemden daha doğrudur.

PARÇA
08 Kantitatif Analiz Sonuçlarını Etkileyen Faktörler

Zayıf doğruluk şunlardan kaynaklanabilir:

Yanlış pik alanı entegrasyonu, numunenin ayrışması veya numune hazırlama sırasında ortaya çıkan yabancı maddeler, mühürlenmemiş numune şişesi, numune veya çözücünün buharlaşması, yanlış numune hazırlama, numune enjeksiyon sorunları, yanlış dahili standart hazırlama

Zayıf hassasiyetin olası nedenleri:

Yanlış tepe entegrasyonu, enjeksiyon veya enjektör sorunları, numune ayrışması veya numune hazırlama sırasında ortaya çıkan safsızlıklar, kromatografik problemler, bozulmuş dedektör tepkisi